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PCR實用技巧
2014/3/29
 
  增加PCR的特異性：

　　1. primers design

　　這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的 一些條件

　　1) 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的primer同樣會降低特異性,并且降低產量

　　2) GC% 40%~60%

　　3) 5’端和中間序列要多GC,以增加穩定性

　　4) 避免3’端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC (有人說：3’ 端最好是 GC/CG/CC/GG。)

　　5) 避免3’端的互補, 否則容易造成DIMER

　　6) 避免3’端的錯配

　　7) 避免內部形成二級結構

　　8) 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5’端, 在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結構是要加上它們

　　9) 使用兼并primer時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3’端使用兼并primer,并使用 較高的primer濃度(1uM-3uM)

　　10) 最好學會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online design et al.

　　* primer的另一個重要參數是熔解溫度(Tm)。這是當50%的primer和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證primer同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比primer的 Tm低5℃。

　　設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的primer。

　　有的是根據GC含量估算Tm。確定primerTm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和 相鄰堿基的特性預測primer的雜交穩定性。大部分計算器程序使用近鄰分析法。

　　根據所使用的公式及primer序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少primer二聚體和非特異性產物的形成。

　　為獲得最佳結果，兩個primer應具有近似的Tm值。primer對的Tm差異如果超過5℃，就會primer在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個primerTm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃

　　或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然后在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

　　2. stability of primers

　　定制primer的標準純度對于大多數PCR應用是足夠的。

　　primer產量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制primer以干粉形式運輸。最好在TE重溶primer，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經常偏酸，會引起寡核甘的水解。 primer的穩定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的primer儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的primer在 -20℃可以穩定保存6個月，但在室溫(15℃到30℃)僅能保存不到1周。干粉primer可以在-20℃保存至少1年，在室溫(15℃到30℃)最多可以保存2個月.
 
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