一、實驗目的
Ø 學習紫外分光光度法測定蛋白質含量的原理;
Ø 掌握紫外分光光度法測定蛋白質含量的實驗技術;
Ø 掌握美析V-1500可見分光光度計的使用方法并了解此儀器的主要構造。
二、實驗原理
紫外-可見吸收光譜法又稱紫外-可見分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波長范圍內的吸收光譜，是以溶液中物質分子對光的選擇性吸收為基礎而建立起來的一類分析方法。紫外-可見吸收光譜的產生是由于分子的外層價電子躍遷的結果，其吸收光譜為分子光譜，是帶光譜。
進行定性:利用紫外-可見吸收光譜法進行定性分析一般采用光譜比較法。即將未知純化合物的吸收光譜特征，如吸收峰的數目、位置、相對強度以及吸收峰的形狀與已知純化合物的吸收光譜進行比較。
定量分析: 紫外-可見吸收光譜法進行定量分析的依據是朗伯-比爾定律：A=lgI0/I=εbc，當入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內，有色物質的吸光度A與該物質的濃度c成正比，即物質在一定波長處的吸光度與它的濃度成線形關系。因此，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度，就可求出溶液中物質濃度和含量。由于最大吸收波長λmax處的摩爾吸收系數最大，通常都是測量λmax的吸光度，以獲得最大靈敏度。
光度分析時，分別將空白溶液和待測溶液裝入厚度為b的兩個吸收池中，讓一束一定波長的平行單色光非別照射空白和待測溶液，以通過空白溶液的透光強度為I0，通過待測溶液的透光強度為I，根據上式，由儀器直接給出I0與I之比的對數值即吸光度。
紫外-可見分光光度計:紫外-可見吸收光譜法所采用的儀器稱為分光光度計，它的主要部件有五個部分組成，即
由光源發出的復合光經過單色器分光后即可獲得任一所需波長的平行單色光,該單色光通過樣品池靜樣品溶液吸收后，通過光照到光電管或光電倍增管等檢測器上產生光電流，產生的光電流由信號顯示器直接讀出吸光度A。可見光區采用鎢燈光源、玻璃吸收池;紫外光區采用氘燈光源、石英吸收池。
本實驗采用紫外分光光度法測定蛋白質含量。蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，因此，蛋白質具有吸收紫外光的性質，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白質吸收波長略有差別）。在最大吸收波長處，吸光度與蛋白質溶液的濃度的關系服從朗伯-比耳定律。該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性，且穩定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優點。
特點：帶光譜
分子光譜
應用：定性分析-最大吸收波長
定量分析-朗伯-比爾定律（標準曲線法和標準加入法）
根據朗伯－比耳定律：A=εbc，只要繪出以吸光度A為縱坐標，濃度c為橫坐標的標準曲線，測出試液的吸光度，就可以由標準曲線查得對應的濃度值，即未知樣的含量。
三、儀器與試劑
美析V-1500可見分光光度計，比色管，吸量管
標準蛋白質溶液：5.00 mg.mL-1溶液
0.9% NaCl溶液，待測蛋白質溶液
四、實驗步驟
〈一〉準備工作
1. 啟動計算機，打開主機電源開關，啟動工作站并初始化儀器。
2. 在工作界面上選擇測量項目（光譜掃描，光度測量），本實驗選擇光度測量，設置測量條件（測量波長等）。
3. 將空白放入測量池中，點擊START掃描空白，點擊ZERO校零。
4. 標準曲線的制作。
〈二〉測量工作
1.吸收曲線的繪制:
用吸量管吸取2mL5.00mg/mL標準蛋白質溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻 度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液為參比，在190 nm～400nm區間，測量吸光度。
2. 標準曲線的制作 ：
用吸量管分別吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5 mL 5.00 mg.mL-1標準蛋白質溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測定各標準溶液的吸光度A278記錄所得讀數。
3. 樣品測定：
取適量濃度的待測蛋白質溶液3 mL，按上述方法測定278 nm處的吸光度。平 行測定三份。
五、數據處理：
1. 以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制吸收曲線，找出最大吸收波長。
由吸收曲線可得最大吸收波長λmax=278nm(圖略)
2. 以標準蛋白質溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。
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標準溶液濃度C(mg/mL) |
吸光度A |
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0.25 |
0.171 |
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0.50 |
0.335 |
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0.75 |
0.482 |
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1.00 |
0.637 |
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1.25 |
0.796 |
濃度C-吸光度A標準曲線方程是：A=0.6208*C+0.0186
曲線擬合優度: R2=0.9998
3. 根據樣品蛋白質溶液的吸光度，從標準曲線上查出待測蛋白質的濃度。
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平行測定次數 |
樣品液吸光度A |
樣品溶液濃度C(mg/mL)
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1 |
0.676 |
1.059 |
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2 |
0.672 |
1.053 |
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3 |
0.674 |
1.056 |
所測溶液平均濃度: C=(C1+C2+C3)/3=1.056 mg/mL
測量的標準偏差： =0.003
相對標準偏差： =0.284%
待測蛋白質溶液濃度為：1.056 mg/mL*10mL/3mL=3.520 mg/mL。
六、思考題:
紫外分光光度法測定蛋白質含量的方法有何優缺點？受哪些因素的影響和限制？
優點：該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性，且穩定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優點。
缺點：儀器昂貴，而且不同的蛋白質的紫外吸收是不相同的，測定結果存在著一定的誤差。
七、注意事項:
1.繪制標準曲線時，蛋白質溶液濃度要準確配制，作為標準溶液;
2.測量吸光度時，比色皿要保持潔凈，切勿用手玷污其光面;
3.石英比色皿比較貴重，使用時要小心。
